La replication chez les eucaryotes, procaryotes, différences et transcription inverse (reverse transcriptase)

Replication chez les eucaryotes


Par rapport aux procaryotes la réplication est plus rare, car l'initiation est très contrôlée, de plus, l'ADN est sous forme de
chromatine. L'ADN s'enroule autour d'un octamère d'histones (200pb autour de (h₂a h₂
b h₃ h₄)₂ ) formant ainsi un nucléosome.

Les ADN polymérases
Il en existe 5 : alpha béta gamma delta epsilon. Alpha delta et epsilon participent à la réplication du chromosome.

ADN polymérase	Nombre de sous unités	Activités
Alpha	4	1 polymérase 2 primases 1 pour le maintient de la structure alpha n'a pas d'activité exonucléasique 3'->5'
Delta	2	1 activité exonucléasique 3'->5' pas d'activité primase, processivité faible
Epsilon	2	1 activité exonucléasique 3'->5' Pas d'activité primase, forte processivité
Béta	1>	impliquée dans la réparation de courts fragments d'ADN
Gamma	1	1 activité exonucléasique 3'->5' responsable de la réplication de l'ADN mitochondriale dont la réplication est indépendante de l'ADN nucléaire

Initiation


Compte tenu de la taille des brins d'ADN chromosomique la réplication a certainement plusieurs origines de réplication.

Chaques origines de réplication est appelée oeil de réplication.


Pour un oeil de réplication, on a 2 complexes multienzymatiques qui
vont en sens inverse. Chez les eucaryotes les fragments d'Okazaki sont
plus petit (environ 200pb). Ces fragments ont à leur extrémité 5' des
fragments d'arn (10 nucléotides) syntéthisés par une primase:

• Soit alpha synthétise les amorces ARN et les allonge sur le brin à
  synthèse discontinue de l'ADN naissant. Pour le brin à synthèse continue
  le complexe ADN polymérase delta/pcna synthétise le brin d'ADN(pcna est
  une protéine qui augmente fortement la processivité).
  
• Soit alpha est uniquement responsable de la synthèse des amorces et
  quelques désoxynucléotides. Le brin continu est répliqué par epsilon;
  delta/pcna réplique le brin discontinu.
  

Dans tous les cas on a sur un brin une ADN polymérase très processive et sur l'autre brin la processivité est moindre.

Lors de la réplication l'adn simple brin est stabilisé grâce à des
protéines : rp-a ou rf-a, équivalent aux ssb chez E.Coli (single
stranded dna binding protein). Les amorces arn sont supprimées par la
rnase h, les trous ainsi formés sont bouchés par béta ou alpha. Les
fragments sont reliés une adn ligase. il existe 3 adn ligase (i, ii,iii)
dont la i est indispensable à la réplication du chromosome. Quand aux
topo-isomérases, il y en a 2 (i et ii).

Terminaison


D'après des études sur SV40 (réplication bidirectionnelle) la réplication s'arrête sous l'effet de contraintes topologiques.

Activite correctrice des ADN polymerases :

• Procaryotes : pour E.Coli (4.10⁶pb) le taux d'erreurs acceptable serait de l'ordre de 10^-6 à 10^-7
  mais la seule complémentarité des bases ne le permet pas. Ceci étant dû
  à la tautomérisation. Si on a ajout d'un nucléotide sous la forme énol,
  le retour à la forme céto provoque un mésappariement. L'ADN polymérase
  est alors bloquée et doit
  revenir en arrière grâce à son activité exonucléasique 3'->5' ( sous
  unité epsilon de l'adn polymérase iii).
  
• Eucaryotes : le génome est beaucoup plus important (homme 3.5 10⁹pb) la fidélité doit être de 10⁹.
  Ceci est peut être dû à une activité exonucléasique 3'->5' sur delta
  et alpha. Plus les polymérases sont processives, plus le taux d'erreurs
  est faible.
  

Replication chez les procaryotes


L'enzyme réplicatif n'est pas l'ADN pol I mais III. L'ADN pol II serait impliquée dans la réparation de l'ADN.


Initiation



E.Coli n'a qu'une origine de réplication. L'initiation se passe en 3 étapes :

• Reconnaissance de la séquence d'origine par une seule protéine.
  
• Ouverture dans une région riche en A et T, proche ou dans l'origine de réplication.
  
• Assemblage du complexe de réplication dans la partie ouverte de l'ADN.
  

L'ouverture de l'ADN se fait grâce à la DNA a, ensuite la DNA b
(hélicase) sépare les 2 brins sur une plus grande distance dans le sens
5'->3'. Pri A agit de la même façon de 3'->5'.

L'ouverture de l'ADN va provoquer des supertours qui vont être
éliminés par l'ADN gyrase (topo-isomérase). Une fois que l'ADN est dans
de bonnes conditions topologiques, l'amorce est synthétisée par la
primase. Ce complexe protéinique est le complexe d'initiation ou
primosome.



Progression de la fourche de replication



Chez E.Coli la principale enzyme est l'ADN polymérase III holoenzyme.
C'est une enzyme réplicative sous la forme d'un dimère asymétrique
constituée de 10 polypeptides (en fait 2*5).

• 3 pour le noyau (core) de l'enzyme:
  
• 
  
  
  
  • alpha : polymérase
    
  • epsilon exonucléase 3'->5'
    
  • psi : activité inconnue
    
  
  
• 2 béta se fixent au core de façon à lier fortement le core à l'amorce et au modèle.
  

La partie très processive s'occupe certainement de la synthèse continue pendant que la partie moins processive s'occupe de la
synthèse discontinue.









L'ADN est déroulé par une ADN hélicase (1) ou DNA B, les supertours
ainsi produits sont éliminés par une topo-isomérase (2) ou ADN gyrase.
Les simples brins d'ADN formés sont stabilisés par des protéines SSB (3)
(single stranded dna binding protein), elles permettent aussi d'éviter
la dégradation de l'ADN par les dnases. La primase (5) synthétise les
amorces ARN (en bleu) des fragments d'Okazaki. La primase est différente
de l'ARN pol : elle est résistante à la rifampicine, synthétise des
courts fragments (10 nucléotides) et n'est pas spécifique de la séquence
d'initiation.

Ces amorces sont ensuites prolongées par l'ADN pol III holoenzyme.
L'ADN pol I prend le relais jusqu'au fragment d'Okazaki suivant, elle
dégrade l'amorce ARN du brin grâce à son activité exonucléasique
5'->3' non spécifique de l'ADN tout en remplaçant le brin d'ARN par
de l'ADN. Une fois que l'amorce ARN a été entièrement remplacée par de
l'ADN les 2 fragments sont reliés covalemment par l'ADN ligase qui forme
une liaison phosphodiester entre un 3' oh et un 5' monophosphate. L'ADN
ligase est inactive sur une extremité 5' monophosphate ARN.

Tout ces enzymes sont ensemble de manière à former un complexe dont
la vitesse peut atteindre 500 à 1000 nucléotides par seconde. Ce
complexe s'appelle le replisome et il peut se charger de la synthèse des
2 brins (précoce et tardif) à condition qu'il y ait une boucle formée
par le brin d'adn tardif. La synthèse se fait sur les 2 brins
simultanément car ils ont la même polarité.





La transcription inverse


La transcription est la réaction de synthèse d'ARN avec comme matrice
un brin d'ADN; cette réaction est catalysée par
l'ARN polymérase ADN dépendante (ou transcriptase). La transcription
inverse est la réaction inverse de la transcription. C'est la synthèse
d'un brin d'ADN à partir d'une matrice ARN grâce à l'ADN polymérase ARN
dépendante ou encore transcription inverse ou reverse transcriptase.

In vivo : comme pour la transcription, une amorce est
nécessaire. L'ADN qui est synthétisé sert en même temps de matrice pour
la synthèse d'un autre brin d'ADN :

L'ADN bicaténaire peut être intégré dans l'ADN de la cellulle hôte,
on parle alors de provirus ou de prophage. Le traitement du SIDA se fait
grâce à un inhibiteur de la reverse transcriptase : l'AZT
(azidothymidine).

In vitro : on peut volontairement synthétiser un
brin d'ADN à partir d'un ARN en particulier de l'ARNm eucaryotique de
façon à avoir un brin d'ADNc (adn complémentaire) que l'on peut
introduire dans un vecteur en vue d'un clonage. Cet ADNc une fois
traduit dans des cellules procaryotiques donne un ARNm sans introns qui
peut être traduit sans trops de problèmes. Ces ADNc peuvent aussi servir
de sondes radioactive (northern ou southern) pour détecter, voir doser
un ARNm correspondant.







Differences entre eucaryotes et procaryotes

	Eucaryotes	Procaryotes
Origine de réplication	multiple	unique
Protéine stabilisatrice de l'ADN simple brin	RP-A ou RF-A	SSB
Amorce ARN	oui synthétisée par alpha suivit par alpha ou béta ou epsilon dégradé par RNAse H trou bouché par alpha ou béta	oui synthétisée par une primase suivit par ADN pol III dégradé par l'ADN pol I trou bouché par l'ADN pol I
ADN polymérases	alpha: 1 polymérase 2 primases pas d'activité exonucléasique 3'->5' delta: activité exonucléasique 3'->5' pas de primase epsilon: activité exonucléasique 3'->5' pas de primase béta: répare les courts fragments d'ADN gamma: réplique l'ADN mitochondrial activité exonucléasique 3'->5'	ADN pol III: 1 polymérase activité exonucléasique 3'->5' ADN pol I: activité exonucléasique 5'->3' 1 polymérase activité exonucléasique 3'->5' ces 2 dernières activités forment le fragment de Klenow
Fragments d'Okazaki	200 nc	2000 nc
ADN ligase	I, II ou III	ADN ligase

Differences entre eucaryotes et procaryotes

	Eucaryotes	Procaryotes
Origine de réplication	multiple	unique
Protéine stabilisatrice de l'ADN simple brin	RP-A ou RF-A	SSB
Amorce ARN	oui synthétisée par alpha suivit par alpha ou béta ou epsilon dégradé par RNAse H trou bouché par alpha ou béta	oui synthétisée par une primase suivit par ADN pol III dégradé par l'ADN pol I trou bouché par l'ADN pol I
ADN polymérases	alpha: 1 polymérase 2 primases pas d'activité exonucléasique 3'->5' delta: activité exonucléasique 3'->5' pas de primase epsilon: activité exonucléasique 3'->5' pas de primase béta: répare les courts fragments d'ADN gamma: réplique l'ADN mitochondrial activité exonucléasique 3'->5'	ADN pol III: 1 polymérase activité exonucléasique 3'->5' ADN pol I: activité exonucléasique 5'->3' 1 polymérase activité exonucléasique 3'->5' ces 2 dernières activités forment le fragment de Klenow
Fragments d'Okazaki	200 nc	2000 nc
ADN ligase	I, II ou III	ADN ligase